科研 南开大学: 多种重金属污染土壤中微生物群落和代谢特征对柽柳根际的响应(国人佳作)

  本研究结果有助于进一步认识柽柳与多种HMs对半干旱土壤ECO的协同效应，为HMs重度污染区的生态恢复提供参考。

  冶炼厂周围的重金属(HMs)污染对土壤微生物群构成严重胁迫。然而，多种HMs和原生植被根际对土壤ECO的共同影响尚不清楚。本研究结合高通量测序和土壤代谢组学，分析了高HMs水平和根际( Tamarix ramosissima )对土壤细菌群落结构和代谢谱的影响。 植物根系通过吸收和稳定土壤中的HMs来缓解HMs的威胁。高HMs水平降低了土壤细菌群落的丰富度和多样性，增加了特殊细菌的数量。 植物根系改变了HMs物种对细菌群落形成的贡献。Cd和Zn是影响非根际土壤细菌分布的重要的因素，而Pb和Cu则是影响根际土壤细菌分布的主要HMs。与根际土壤相比，HMs在非根际土壤中诱导更多的优势耐金属细菌。同时，共现网络中关键代谢物因根际而异。此外，同一HMs耐药细菌受不同代谢物的调控，如非根际土壤中十二烷酸促进了 unclassified family AKYG1722 ，而其在根际土壤中受2-甲基十八烷促进。本研究表明， 高HMs水平和根际影响土壤性质和代谢物，从而重塑土壤微生物群落结构。

  多种HMs暴露对所选区域的土壤环境构成严重威胁，利用内梅罗指数(Nemerow index)评估其协同效应。土壤中5种HMs的含量如图1所示。远离离冶炼厂的土壤样品(L-1和L-2)显示出低水平的HMs污染，虽然它们超过了甘肃省白银市的背景值(Cu：22.48 mg/kg、Cd：0.087 mg/kg、Pb：20.53 mg/kg、Zn：57.16 mg/kg、As：10.82 mg/kg)(CNEMC中国土壤元素自然背景值，和GB15618-2018的风险筛选标准。在冶炼厂周围所有场地(样品H-1-H-5)都发现了5种HMs的高含量。Nemerow指数显示，所有土壤样品都受到了严重污染，其中Cd因其较强的生态效应发挥了最重要的作用，其他超过背景值的HMs由高到低依次为PbZnCuAs (图1f)。冶炼厂周围的土壤样品中，Cu、Cd、Zn、Pb和As的浓度范围分别为60-2833 mg/kg、52-802 mg/kg、633-24912 mg/kg、384-15801 mg/kg和37-167 mg/kg。有必要注意一下的是，重度污染场地之间的差异仍然很大。基于Nemerow指数，本研究土壤样品的污染程度排序为H-1-H-5 L-1-L-2。对于大多数土壤样品，根际土壤中的Nemerow指数较非根际土壤明显降低( p 0.05)。5种HMs中，柽柳( Tamarix ramosissima )的存在使土壤Cu含量明显降低( p 0.05)。在不同气候的湿地也观察到了类似的现象，这被认为是植物吸收的结果。与非根际土壤相比，根际土壤Cu含量降低了79.2%。有趣的是，除H-2和H-5样品根际土壤中Pb和Zn含量高于非根际土壤外，其余样品根际土壤中Pb和Zn含量均低于非根际土壤，且根际土壤和非根际土壤中Pb和Zn含量的相对变化规律相似。 与总HMs相比，HMs的可交换部分作为一种生物可利用(Bae)形式，可能直接威胁当地的生态安全。每个HM的生物有效性因物种而异(图1)，其中Cu的生物有效性最低，仅占总Cu的0.7% ~ 2.3%，其次是As(7.0% ~ 7.9%)、Pb(10.0% ~ 80.6%)、Zn(14.1% ~ 72.6%)和Cd(39.4% ~ 77.9%)。在研究的5种HMs中，虽然土壤中Cd的总含量不是最高的，但Cd的生物有效性与迁移率最高，具有潜在的生态风险，而Cu和As在土壤中相对更稳定且不易释放。与低HMs水平相比，高HMs水平导致其在土壤中的生物有效性更高，尤其是Pb、Cd和Cu，表明这3种HMs随着其含量的增加在土壤中的固定能力有限，具有较高的生态风险。通常，HMs的可交换部分显著影响植物对HM的吸收，并呈现出比HM总含量更好的线性关系。然而，尚未有报道称柽柳是一种超富集植物，因此我们假设它通过降低根际土壤中HMs的生物有效性来限制污染生境中HMs的摄入。有必要注意一下的是，柽柳对HMs的稳定作用似乎因HMs种类而异。与非根际土壤相比，根际土壤Zn和Pb的生物有效性较降低，而Cu的生物有效性较非根际土壤提高。但有必要注意一下的是，Cd在根际土壤中的生物有效性仍处于较高水平，且容易迁移，构成生态威胁。因此，柽柳通过吸收和稳定HMs来缓解HMs对土壤细菌群落的胁迫，这与HMs的种类、总含量和生物有效性有关。 土壤理化性质会响应生物群与土壤之间的相互作用，并且该过程可能受到HMs的影响。如表1所示，该地区土壤养分贫乏，呈微碱性。土壤pH、土壤有机质(SOM)和CEC被认为是影响土壤中HMs生物有效性的重要的因素。与低HMs污染水平(L-1-L-2)相比，高HMs污染(H-1-H-5)导致非根际土壤和根际土壤的pH和CEC明显降低，低pH和CEC意味着HMs的高流动性。通常，更多的外部HMs输入会导致更高的HMs迁移率。高HMs污染的土壤中Pb、Cd和Cu的生物有效性含量和比例均有所增加(图1)。低HMs污染水平下，根际土壤的CEC高于非根际土壤。但在高HMs污染水平下没有观察到类似的增加。此外，有效氮被认为是土壤养分状况的重要典型指标。在干旱地区，植物会采取提高氮吸收的策略。提高有效氮含量和植物根系富集被认为是有效的方法。本研究结果证实，无论HMs水平高低，柽柳根系的存在都会增加土壤NO 3 - -N含量(表S2)， 并可能受 到根际土壤HMs相对减少的影响，因为HMs抑制了土壤硝化作用。

  注：数据是平均值±标准误差（SE；n=3）。不同字母表示七个样本间差异显著（ p 0.05）。在土壤-水混合物（1:2.5，w/v）中测量土壤pH值。

  图1a-e:各采样点非根际和根际土壤重金属总含量和生物可利用重金属含量，f:各采样点的Nemerow指数。

  Total和Bac分别是HMs的总含量和生物可利用含量。NR和R分别为非根际和根际。不同小写字母和大写字母分别表示不同地点非根际土壤和根际土壤的HMs含量和Nemerow指数存在非常明显差异(p0.05)。

  细菌群落与土壤生态功能紧密关联，也与植物生长密切相互作用。利用Illumina MiSeq平台对土壤细菌16S rRNA基因进行高通量测序，以确定土壤细菌群落对HMs暴露和柽柳的响应。总体上，我们从14个土壤样品(非根际和根际)获得565,233个序列，其中从非根际土壤样品中检测到的平均序列数为43,152，根际土壤样品中检测到的平均序列数为42,530。每个样品的序列被归一化为35,084个序列，这对应于序列最少的土壤样本的大小。 采用Shannon指数和Chao 1指数确定细菌群落的多样性和丰富度。与低HMs水平(L-NR和L-R)相比，高HMs水平(H-NR和H-R)降低了土壤细菌群落的多样性和丰富度(Shannon和Chao 1指数)(图2a)。同时，多样性和丰富度对同一HMs水平的植物根系的存在没有表现出明显的响应。这原因是HMs对该地区的影响相当强烈，掩盖了根际效应造成的差异。在其他被有机肥、化肥以及碳氢化合物污染的土壤中也报告了类似的结果。在长期的选择压力下，与低水平的HMs相比(107和137个OTUs)，高水平的HMs产生更多的特殊细菌(231和305个OTUs)(图2b)。此外，无论HMs水平高低，根际土壤中OTUs数量均低于非根际土壤。因此，高HMs水平对特殊OTUs数量的影响大于对根际的影响。在所有土壤中，最常检测到的细菌门是放线菌门( Actinobact eria)、绿弯菌门(Chlorofle xi )、变形菌门( Proteobacteria )、拟杆菌门( Bacte roidota)、芽单胞菌门( Gemmatimonadota )、 Deinococcota 、Patescibacteriota、厚壁菌门( Firmicutes )，如图2c所示。本研究中发现的最主要细菌门与其他HMs污染土壤中的细菌门相似。在前30个门中，Chloroflexi、Patescibacteria和RCP2-54显示出对HMs水平和植物根系的显著响应(图2d)。根际效应导致绿弯菌门(Chlorofle xi )相对丰度下降，高HMs水平逐步加强了根际与非根际土壤之间的差异。同时，有报道称Chloroflexi能改善土壤细菌活性和养分循环，表明高HMs水平与植物根系相结合对土壤养分循环产生负面影响。Patescibacteria由于在高HMs含量的土壤中大量增加而被认为具有HMs耐受性，并且它们所包含的成员也体现在纲、目、科和属水平上(图S2a)。OTU水平细菌群落的层次聚类树(图S2b)显示低HMs组(L-NR和L-R)聚在一起，远离高HMs组。PCoA分析显示，非根际土壤细菌群落的聚集位置从低HMs组(包括非根际和根际)显著转移到高HMs组位置。同时，大部分根际土壤样品在PC2的负轴上密集堆积，而非根际土壤样品在PC2的正轴上聚集，表明非根际和根际土壤存在非常明显差异。 采用方差分解分析(VPA)解释根际、生物有效HMs和土壤理化性质 引起的 细菌群落变化。图S4显示，根际效应和HMs在细菌群落迁移中比土壤性质起更重要的作用。与非根际土壤相比，5种HMs对根际土壤细菌群落的影响发生了变 化(图3a和3b)，这与之前的结果相似。冗余分析(RDA)结果显示，土壤中总/生物有效HMs和Nemerow指数分别可以解释85%(非根际)和87%(根际)的变异，但HMs的生物有效性组分的影响更显著(表S3)。HMs的协同作用抑制了非根际和根际土壤中细菌群落分布。Cd和Zn是非根际土壤中细菌分布的主要贡献者(图3a)，而Pb和Cu则成为根际土壤中最重要的有毒元素(图3b)，表明细菌对HMs的反应受植物根系存在的影响。 此外，特定的细菌对根际或/和过多的HMs暴露有反应。在长期的选择压力下，一些土壤细菌进化出了对HMs的耐受性，并对HMs表现出积极的响应，如Chloroflexi和Patescibacteria(图3d)。类似的反应出现在它们较低的水平，如 unclassified family AKYG1722 、 Thermobaculaceae( 绿弯菌门 ) 、Sacchrmonadales、 unclassified family LWQ8 、 TM7a (Patescibacteria)(图S3)，表明它们是耐HMs的微生物。先前的研究表明， unclassified family AKYG1722 和Sacchrimonadales是HMs耐受微生物。通常，耐受细菌在HMs污染的土壤中表现出更高的丰度。本研究中，上述耐受细菌的丰度随HMs含量的增加而增加。同时，细菌与植物的合作被认为是它们抵抗外界胁迫的有效途径。所有处理中 Myxococcota 相对丰度的变化表明，对于特定的细菌，当地植物的生长会削弱对土壤细菌的威胁。例如，较高的HMs水平提升了 Halomonas 的相对丰度，这有利于植物在干旱和盐渍土壤中的生长。 土壤理化性质是塑造微生物群落的主要的因素，HMs水平和柽柳的存在改变了部分理化性质(表1)。通过冗余分析评估土壤理化性质的影响，图3c给出了土壤理化性质与微生物丰度的关系。理化性质的变化对细菌群落整体分布的直接影响主要是由于pH和NH 4 + -N( p 0.05)。在HMs污染土壤中，pH值较低的样品细菌群落多样性和丰富度相比来说较低。研究之后发现，NH 4 + -N的影响是塑造中国西南不同海拔土壤微生物群落的重要的因素。本研究中，pH和NH 4 + -N是HMs污染土壤中细菌群落形成的最重要的条件，但NH 4 + -N的变化不是由土壤中HMs暴露水平的差异引起的。观察了非根际土壤和根际土壤中土壤性质与特定微生物物种之间的关系(图3d, e)。在非根际土壤中，CEC是对厚壁菌门和 Myxococcota 产生积极影响的关键环境变量( p 0.05)；而在根际土壤中，pH是对酸杆菌门和Armatimonadota产生积极影响的关键环境变量( p 0.05)。此外，根际土壤中NO 3 - -N含量高于非根际土壤，由于根际土壤中NO 3 - -N的富集，其与多种细菌物种产生了明显的剂量效应关系(图3e)。

  此外，Tax4Fun应用于16S rRNA数据，以计算京都基因和基因组百科全书(KEGG)途径的相对丰度，进一步预测由HMs和根际效应引起的细菌功能变化。共检索到6163条KO，并将其解析映射到264条KEGG通路中(表S4)。根据Tax4Fun预测结果，26条通路受到过度HMs暴露或/和根际效应的显著调节(p0.05)，包括14条代谢途径。土壤HMs污染导致微生物碳代谢发生明显的变化，如分解代谢增加和合成代谢减少。在本研究中，各通路对HMs胁迫表现出不同的反应。在非根际和根际土壤中，淀粉和蔗糖代谢、醚脂代谢和花生四烯酸代谢受到抑制，而丙酮酸代谢、脂肪酸伸长和二甲苯降解得到促进。同时，植物根系的存在削弱了HMs对上述一些代谢的影响。此外，还研究了涉及HMs的KO差异以及不同组的胁迫缓解情况。如t检验结果所示，根际效应提高了一个编号为K07387的KO的相对丰度，该KO被定义为假定的金属蛋白酶(表S5)。据报道，金属蛋白酶具有盐稳定性，在超积累植物东南景天(Sedum alfredii)中，当植物遭受Zn和Cd胁迫时，其基因增加。这可能是植物改变细菌对HMs的反应并帮助某些细菌耐受HMs的一种潜在机制。有必要注意一下的是，V3-V4区域的预测是有限的，因此进行了更具体的代谢物谱来研究土壤代谢对HMs和根际效应的响应。

  a：细菌群落丰富度和多样性对植物根系或/和多种HMs的响应；b：各组OTUs数量的维恩图；c：门水平不同组的细菌分布；d：门水平上各组的差异细菌。* 0.01p≤0.05；** 0.001p≤0.01；*** p≤0.001。

  a,b ：非根际和根际土壤中生物可利用HMs与细菌群落的冗余分析(RDA)；c：理化性质与整体细菌群落之间的RDA；d,e：理化性质和生物可利用HMs影响非根际和根际土壤中特定细菌的Spearman相关性分析。* 0.01p≤0.05；** 0.001p≤0.01；*** p≤0.001。

  利用土壤代谢组学分析解释高HMs水平和根系调控下土壤微生物及其功能的变化。在本研究中，有机酸、碳氢化合物和糖被确定为主要的土壤代谢物(图4a)。sPLS-DA分析结果为，不同处理之间的各种代谢物存在非常明显差异，表明HMs水平和根际显著干扰了土壤代谢谱(图4b)。随着不同处理之间的显著变化，在所有已鉴定的代谢物中，观察到14种差异代谢物对更多的HMs和/或根际作出响应(VIP1，p0.05)(表S5)。为了应对环境胁迫，植物和土壤微生物会调节它们的代谢过程。柽柳的存在降低了土壤中尿素和部分次生代谢物的积累，从而调节了土壤中氮和其他养分的迁移，如根际土壤中NO3--N的富集。同样，大多数碳氢化合物的含量由于植物根系的存在而显著减少，如已被报道为植物生长促进剂的二十二烷和二十烷。植物根系的吸收和吸附可以解释这种现象。然而，脂肪酯的相对丰度得到了改善，如十二烷酸、2-棕榈酰甘油、1-单棕榈酸酯、单硬脂酸甘油酯。同时，硼酸作为一种主要来自于植物凋落物的重要土壤代谢物，也表现出类似的反应，在本研究中被确定为常见的差异代谢物。高HMs污染的根际土壤中硼酸的显著富集可能是由于高HMs水平引起的植物根凋落物韧性降低和分解造成的。此外，高水平的HMs暴露减弱了根际对代谢物的影响。无论是非根际土壤还是根际土壤，有机酸和糖的产生对HMs均呈负反应，表明HMs比植物根系发挥更重要的作用。糖和有机酸是形成暴露于HMs的土壤细菌群落的驱动因素。HMs和植物根系调控的土壤碳代谢可能是生态系统抵御外界胁迫的一种策略，而这一过程能够最终靠改变HMs的生物有效性来实现。这些标志代谢物在土壤-植物系统中的作用仍有待进一步验证。

  图4 所有组中所有土壤代谢物的热图(a)和土壤代谢物的稀疏偏最小二乘判别分析(sPLS-DA) (b)。

  HMs能改变土壤微生物代谢物和根际土壤代谢物，促进新优势微生物群落的形成。据报道，土壤代谢物与细菌活动紧密关联。本文利用共现网络来研究土壤环境变量(含HMs和土壤理化性质)、前30种细菌属和代谢物之间的相互作用。考虑到多个HMs的复合污染，结合Nemerow指数在网络中做评估。由于对HMs和根际的细菌响应者不同，我们观察到共现网络在非根际土壤和根际土壤中分别响应环境变量、细菌群落和代谢物的强烈分布。根据结果得出，土壤代谢物对微生物群落的形成至关重要(图5)。而且，由于关键节点的不同，非根际土壤(图5a)和根际土壤(图5b)之间复杂而密切的相互作用表现出差异。在根际土壤中，HMs与细菌种类的负相关多于正相关，但在非根际土壤中，负相关数量减少。这在某种程度上预示着HMs能抑制根际土壤中的大多数细菌，但一些细菌在不受植物影响的情况下对HMs产生了耐受性。此外，在属水平上，对HMs梯度的响应大多数来源于于土壤中的优势菌门：绿弯菌门和放线c)。无论非根际或根际土壤，HMs与代谢物的正连接多于负连接，这在某种程度上预示着HMs可能有利于增加大多数代谢物的含量来调节土壤细菌群落。除初级代谢物2-棕榈酰甘油、十二烷酸和烷烃(2-甲基-庚烷和十八烷)外，根际和非根际土壤共现网络中的关键代谢物差异较大。 在非根际土壤中(图5a)，总Cd/Zn和生物可利用Cd/Zn始终是塑造细菌群落的优势HMs。Nemerow指数作为多种HMs污染土壤的综合评价指标，也是一个相对关键的因素。在所选区域， unclassified family AKYG1722 和 Thermobaculum (绿弯菌门)被报道为土壤中HMs的指示菌，能适应多种HMs对环境造成污染。其中， unclassified family AKYG1722 和 Thermobaculum 分别与Zn和Cd呈正相关， unclassified family AKYG1722 富集与十二烷酸呈正相关。根据结果得出， unclassified family AKYG1722 通过十二烷酸渗出耐受Zn胁迫。在Cd、Zn、1-单棕榈酸酯、2-棕榈酰甘油和耐HMs的 unclassified family Solirubrobacteraceae (放线菌门)、 unclassified order Saccharimonadales Saccharimonadales (Patescibacteria)中也观察到了类似的关系。上述有机物也是该地区土壤的重要代谢物，属于放线菌门和绿弯菌门的耐HMs细菌通过分泌这些有机物来缓解Zn和Cd胁迫。有益细菌受到HMs的抑制，即有益细菌 Pontibacter (拟杆菌门)的生长受到总Cd和生物可利用Cd的负面影响。 Pontibacter 是一个耐Cd菌属，当土壤Cd含量低于25 mg/kg时，它与Cd的生物累积显著相关。在所选区域，高Cd含量(52 ~ 802 mg/kg)(图1b)可能对土壤中的 Pontibacter 产生了负面影响，这与上述参考文献的结果不一致，因为其Cd污染严重。此外，Cd对一些代谢物(如1-单棕榈酸酯、2-棕榈酰甘油和甘油单硬脂酸酯)产生正面影响，然后对 Pontibacter 等细菌属产生负面影响。同样， unclassified familyJG30-KF-CM45 (绿弯菌门)、 Arthrobacter (放线菌门)和 unclassified order Frankiales (放线菌门)与Zn呈显著负相关( p ＜0.05)。此外，Zn通过富集十二烷酸降低了 unclassified family JG30-KF-CM45 的丰度。 unclassified family Longimicrobiaceae ( Gemmatimonadota ) 与Cd和Zn呈负相关，这些HMs通过富集1-单棕榈酸酯和2-棕榈酰甘油促进其丰度。此外，Cd对二十碳烷产生负面影响，降低了 Pontibacter 和 unclassified family Longimicrobiaceae 的丰度。

  在根际土壤中(图5b)，几种代谢物成为网络中的重要的因素，与HMs的影响相比，2-棕榈酰甘油和(Z)-Docos-9-烯腈的作用至关重要。根际通过释放根系分泌物和植物对HMs的吸收，极大地影响土壤性质、总HMs和生物可利用HMs。已经观察到，在大多数位点样本中，根际土壤的总或生物可利用HMs含量低于非根际土壤(图1a-e)。这些变化将影响土壤微生物群落代谢物的产生和消耗。如前所述，根际代谢物是重塑土壤微生物群落结构并诱导某些细菌物种优势的直接驱动因素之一。Unclassified class Gitt-GS-136(绿弯菌门)是重要细菌属，据报道，当暴露于低于40 mg/kg的镉环境中时，它是耐镉细菌。而在重度HMs污染土壤中，其对Cu、Zn和Pb表现出明显的负反应。同时，其代谢受上述过程的调节，如2-棕榈酰甘油和(Z)-Docos-9-烯腈的增加，庚烷的减少。与含有不同HMs耐受细菌的非根际土壤相比，只有unclassified family AKYG1722 (绿弯菌门)和unclassified family Microbacteriaceae (放线菌门)是耐Cu和耐Zn/Pb/As的成员，它们的丰度与根际土壤中HMs含量呈正相关。有必要注意一下的是，它们分别与代谢物2-甲基十八烷和十二烷酸、1-碘代十六烷共发生，并且与非根际相似，表明2-甲基十八烷和十二烷酸可能是细菌对HMs耐受的关键代谢物。与非根际土壤不同，根际土壤的代谢物与细菌成员强烈共现。高水平的HMs降低了根际土壤的pH值和CEC(表1)，从而调节了根系分泌物，如硬脂酸、乳酸，然后降低了关键细菌的丰度，如unclassified class TK10(绿弯菌门)，unclassified family JG30-KF-CM45 (绿弯菌门)。此外，受影响的根分泌物十二烷酸与unclassified family Longimicrobiaceae (Gemmatimonadota)强烈共现。细菌和代谢物之间的这些相互作用被认为是植物缓解HMs毒性的重要协助。

  图5 非根际和根际土壤细菌类群、土壤特性(包括生物可利用HMs和理化性质)和土壤代谢物的共现分析。

  本研究主要探讨了多种HMs干扰非根际和根际微环境的机制。本研究结果证实，柽柳的生长通过吸收和稳定根际土壤中的HMs来减弱其生态毒性，尤其是Cu，其总含量和生物有效性明显降低。高HMs水平和根际影响土壤性质和代谢产物，从而重塑土壤微生物群落结构。高HMs水平降低了土壤细菌群落的丰富度和多样性，增加了特殊细菌的数量。根际在属水平上诱导的优势耐金属细菌较少，且具有不一样的关键代谢物调节细菌。本研究结果有助于进一步认识柽柳与多种HMs对半干旱土壤ECO的协同效应，为HMs重度污染区的生态恢复提供参考。